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考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的原理、步驟及注意事項

更新時間:2019-09-24      點擊次數:4925

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的原理、步驟及注意事項

 

關鍵詞:紫外分光光度計;蛋白質濃度;美析儀器; UV-1100;UV-1200

 

      蛋白質濃度測定的方法有很多,考馬斯亮藍測定蛋白質是實驗室zui常見的一種方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便,下文介紹了考馬斯亮藍測定蛋白質濃度的原理、優缺點、操作以及注意事項。

 

實驗原理

      考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質濃度,是利用蛋白質―染料結合的原理,定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質測定法。

      考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的zui大吸收峰(lmax)的位置,由465nm變為 595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。

 

考馬斯亮藍染色法的突出優點是:

      (1)靈敏度高,據估計比Lowry法約高四倍,其zui低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的消光系數,因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

      (2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內保持穩定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩定性。因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

      (3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

 

此法的缺點是:

      (1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。

      (2)仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。

 

試劑與器材

一、試劑

考馬斯亮藍試劑:

考馬斯亮藍G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中,加入100mL 85%磷酸,用蒸餾水稀釋至1000mL。

 

二、標準和待測蛋白質溶液

1.標準蛋白質溶液

      結晶牛血清蛋白,預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2.待測蛋白質溶液。

      人血清,使用前用0.15mol/L NaCl稀釋200倍。

三、器材

      試管1.5×15cm(×6),試管架,移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒溫水浴;分光光度計,美析UV-1100;UV-1200。

 

操作方法

一、制作標準曲線

取7支試管,按下表平行操作。

試管編號                      0   1     2       3       4       5       6

標準蛋白溶液(mL)      0  0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

                              0.1   0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04

考馬斯亮藍試劑(mL)        5mL

搖勻,1h內以0號管為空白對照,在595nm處比色

A595nm                                                   

繪制標準曲線:以A595nm為縱坐標,標準蛋白含量為橫坐標,在坐標紙上繪制標準曲線。

 

二、未知樣品蛋白質濃度測定

      測定方法同上,取合適的未知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值,在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量,從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。

 

注意事項

      在試劑加入后的5-20min內測定光吸收,因為在這段時間內顏色是zui穩定的。

測定中,蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上,測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。

       利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用,重復測定吸光度時,比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標準曲線的時候,蛋白標準品是從低濃度到高濃度測定,防止誤差。

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